实验方法总结

支架与对照制备：Rhinoceros 3D建模；MeshLab网格简化；Describe切片：层厚1.0μm、hatch0.2μm、6道轮廓、15°拼接角、5μm叠合；DiLL模式写入OrmoComp于Ormoprime处理玻片；曝光功率/扫描速率80%/80mm·s⁻¹；后处理：PGMEA-IPA交换、N₂吹干。平面对照用PDMS模具成形的OrmoComp膜。

预处理与表面改性：紫外灭菌1.5h；6d预浸培养基（隔日换液）；PDL（5μg·mL⁻¹，10min）+Laminin（10μg·mL⁻¹，2h）。

细胞与培养：HIP-009 hNSC；生长/过渡/分化培养基配方含Laminin与BDNF/GDNF等；常压6%CO₂、5%O₂。分化实验接种密度约6.5×10⁴cells·cm⁻²，总培养28d。

成像与分析：CLSM（405/488/561nm；10×/20×；切片厚0.8-1.59μm），按高度分层做最大强度投影；SEM前经乙醇梯度脱水与金喷镀。图像处理采用ImageJ Huang阈值二值化；区域（Tube/Supports/Outside）以Rhino脚本掩模对齐；强度/覆盖率双路径量化；统计用MATLAB，Student t-test，显著性以*/**/***标注（详见图8-图10）

采用双光子光刻设备在OrmoComp树脂中刻写希尔伯特微毛细管支架：腔径约80μm（高于5-10μm生理毛细管，但便于未来内皮铺装与灌流），膜/支撑梁直径15μm；膜面椭圆孔8×5μm，沿长/短轴节距16/8μm；膜基底垂向距离50μm。25×浸没物镜下体素约0.6×3.3μm（宽×高）。为抑制侧壁孔闭合，孔形进行约1.5×径向拉伸优化；在视场拼接处引入支撑环以提升结构稳定性与刻写一致性。

图1 基于TPL的希尔伯特微毛细管支架设计与制造流程

（a）支架结构的3D渲染模型，包含毛细管样管腔、多孔膜、支撑梁及涂覆OrmoPrime的玻璃基底；

（b）支架设计细节及尺寸标注：80μm管腔直径（大于天然毛细血管，但处于脑内小动脉/小静脉尺寸范围）、15μm管壁与支撑梁直径、8μm×5μm椭圆形孔隙（沿轴向间距分别为16μm和8μm），该尺寸设计兼顾结构完整性、神经突延伸空间与物质扩散需求；

（c）TPL工艺示意图，近红外飞秒激光诱导OrmoComp树脂局部聚合，估算体素尺寸为600nm（宽度）×3300nm（高度）；

（d）打印支架的SEM图像，显示高结构保真度与精细特征保留；

（e）支撑梁连接相邻打印区域的SEM图像，无结构断裂；

（f）多孔膜侧壁的高倍SEM图像，孔隙边界清晰。

图2 基于活/死染色法的hNSCs在TPL微毛细管支架上的存活率评估

（a）第0天接种hNSCs的代表性荧光图像；

（b）相同条件下玻璃对照组hNSCs的荧光图像；

（c）预分化28天后接种于支架的hNSCs荧光图像；

（d）预分化28天后接种于玻璃对照组的hNSCs荧光图像，存活率与支架组相近；

（e）微毛细管支架与玻璃对照组的细胞存活率定量对比（*p<0.05）。

图3 hNSCs在微毛细管支架上培养过程中的相差显微镜图像

（a）第3天（DIV 3）平面玻璃基底上的hNSCs，分布稀疏且聚集性低；

（b）DIV 9平面基底上的早期神经玫瑰花结形成，细胞呈中心聚集并向外延伸突起；

（c）DIV 13平面基底上的成熟神经玫瑰花结，中心细胞体密集排列；

（d）DIV 3支架上的hNSC分布，支架内部细胞数量少于周围基底；

（e）DIV 9支架上的hNSC分布，支架边缘细胞密度增加但内部仍较少；

（f）DIV 13支架上的hNSC分布，支架中心平面区域细胞密度与对照基底相近，但无神经玫瑰花结形成；

（g）DIV 3支架局部特写，细胞仅存在于支架平面基底（*），支撑梁上无细胞；

（h）DIV 9支架局部特写，细胞存在于支架基底（*）、沿支架边缘迁移（**）并附着于支撑梁（***）；

（i）DIV 13支架局部特写，细胞在支架边缘形成聚集（**）并完全整合到支撑梁（***）。

图4 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）与SEM分析DIV 14和DIV 28时hNSCs在希尔伯特微毛细管支架上的组织排列

（a）DIV 14的最大强度投影图像，GFAP阳性星形胶质细胞（红色）主要位于支架周围平面区域，与βIII-微管蛋白阳性神经元（绿色）混合分布；支架内部星形胶质细胞沿支撑梁排列，突起跨越支撑梁与毛细管膜间隙，神经元则靠近支架并在毛细管膜形成早期神经网络；

（b）DIV 28的最大强度投影图像，星形胶质细胞完全包裹支撑梁，向毛细管膜延伸的突起更密集，神经元网络扩展且支架内连接性增强；

（c）DIV 14微毛细管入口处细胞整合的SEM图像；

（d）星形胶质细胞沿支撑梁延伸突起的SEM特写；

（e）单个细胞突起跨越支撑梁与毛细管膜间隙的SEM图像，细胞体连接支架不同结构；

（f）DIV 14毛细管膜上的神经元网络SEM图像，细胞体优先定位于膜孔隙处；

（g）DIV 28微毛细管入口处细胞整合的SEM图像，细胞覆盖度显著提高；

（h）星形胶质细胞沿支撑梁形成密集突起的SEM特写；

（i）支撑梁上细胞向毛细管膜延伸大量突起并与膜上神经元接触的SEM图像；

（j）DIV 28毛细管膜上的致密神经元网络SEM图像，神经突更粗且与支撑梁结构形成连接；

（k）倾斜视角SEM图像，捕捉到支撑梁（上下层）与毛细管膜之间的细胞突起；

（l）毛细管管口处悬浮的致密细胞聚集物SEM图像，类似神经玫瑰花结的局部聚集；

（m）支撑梁之间的细胞外基质（ECM）沉积SEM图像，表明支架整合与细胞重塑。

图5 CLSM图像显示DIV 14时hNSCs在支架不同高度层的分布

（a）顶层（120-180μm）的最大强度投影；

（b）顶层中心管段特写，星形胶质细胞包裹支撑梁；

（c）顶层末端管段特写，星形胶质细胞突起跨越支架结构间隙；

（d）中层（60-120μm）的最大强度投影；

（e）中层中心管段特写，星形胶质细胞突起连接毛细管膜与支撑梁；

（f）中层末端管段特写，星形胶质细胞与神经元向相邻支架结构延伸大型突起；

（g）底层（0-60μm）的最大强度投影；

（h）底层中心管段特写，神经网络集中于微毛细管膜附近；

（i）底层末端管段特写，神经元在管口附近形成聚集，星形胶质细胞沿支撑梁排列。

图6 CLSM图像显示DIV 28时hNSCs在支架不同高度层的分布

（a）顶层（120-180μm）的最大强度投影；

（b）顶层中心管段特写，星形胶质细胞包裹支撑梁并延伸更大规模突起；

（c）顶层末端管段特写，星形胶质细胞与神经元向支架结构间延伸突起；

（d）中层（60-120μm）的最大强度投影；

（e）中层中心管段特写，星形胶质细胞与神经元突起广泛连接毛细管膜与支撑梁；

（f）中层末端管段特写，神经元沿垂直支柱形成连接，星形胶质细胞持续包裹支撑梁；

（g）底层（0-60μm）的最大强度投影；

（h）底层中心管段特写，毛细管膜附近神经网络密度显著增加；

（i）底层末端管段特写，神经元沿支架基底形成互联网络，星形胶质细胞与支撑梁边缘对齐。

图7 CLSM图像显示DIV 14和DIV 28时hNSCs在希尔伯特微毛细管支架与OrmoComp对照组上的分化情况

（a）DIV 14支架上的hNSCs，经βIII-微管蛋白（神经元）、GFAP（星形胶质细胞）与DAPI（细胞核）染色，神经元集中于管腔区域；

（b）DIV 14 OrmoComp对照组上的hNSCs，神经元分布无空间特异性；

（c）DIV 14支架上的hNSCs，经突触素、GFAP与DAPI染色，无突触素表达；

（d）DIV 14 OrmoComp对照组上的hNSCs，突触素表达同样极低；

（e）DIV 14支架上的hNSCs，经巢蛋白、GFAP与DAPI染色，巢蛋白广泛表达；

（f）DIV 14 OrmoComp对照组上的hNSCs，巢蛋白集中于神经玫瑰花结；

（g）DIV 28支架上的hNSCs，经βIII-微管蛋白、GFAP与DAPI染色，管腔区域神经元密度显著增加；

（h）DIV 28 OrmoComp对照组上的hNSCs，神经元仍局限于玫瑰花结中心；

（i）DIV 28支架上的hNSCs，经突触素、GFAP与DAPI染色，突触素呈弱表达；

（j）DIV 28 OrmoComp对照组上的hNSCs，突触素表达仍较低；

（k）DIV 28支架上的hNSCs，经巢蛋白、GFAP与DAPI染色，巢蛋白仍在支架区域表达；

（l）DIV 28 OrmoComp对照组上的hNSCs，巢蛋白集中于玫瑰花结内部。

图8 DIV 14和DIV 28时βIII-微管蛋白、GFAP与DAPI表达的荧光强度分析

（a）DIV 14的RGB强度曲线，所有区域GFAP表达均高于βIII-微管蛋白，曲线周围阴影为标准差；

（b）DIV 14分析区域对应的CLSM图像；

（c）DIV 28的RGB强度曲线，支架内部βIII-微管蛋白表达超过GFAP，外部仍以GFAP为主；

（d）DIV 28分析区域对应的CLSM图像；

（e）支架分析区域定义：管腔（Tube）、支撑梁（Supports）、外部（Outside）；

（f）DIV 14各区域荧光强度定量，管腔区域βIII-微管蛋白最高，外部区域GFAP占优；

（g）DIV 14各染色标记的荧光强度对比，区域间差异显著；

（h）DIV 28各区域荧光强度定量，管腔与支撑梁区域βIII-微管蛋白表达高于GFAP；

（i）DIV 28各染色标记的荧光强度对比，外部区域仍以GFAP为主（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

图9 DIV 14和DIV 28时星形胶质细胞与神经元覆盖比例的二值化CLSM分析

（a）OrmoComp对照组与支架各区域的星形胶质细胞覆盖比例，对照组覆盖度更高；

（b）DIV 14对照组星形胶质细胞的二值化图像；

（c）DIV 28对照组星形胶质细胞的二值化图像，可见玫瑰花结形成（+）；

（d）DIV 14支架星形胶质细胞的二值化图像；

（e）DIV 28支架星形胶质细胞的二值化图像；

（f）神经元覆盖比例定量，DIV 14时支架各区域神经元覆盖度显著高于对照组；

（g）DIV 14对照组神经元的二值化图像；

（h）DIV 28对照组神经元的二值化图像，玫瑰花结内神经元覆盖度增加（+）；

（i）DIV 14支架神经元的二值化图像；

（j）DIV 28支架神经元的二值化图像（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

图10 DIV 14和DIV 28时细胞核与祖细胞（巢蛋白阳性）覆盖比例的二值化CLSM分析

（a）对照组与支架各区域的细胞核覆盖比例，对照组密度更高；

（b）DIV 14对照组细胞核的二值化图像；

（c）DIV 28对照组细胞核的二值化图像，玫瑰花结内聚集明显（+）；

（d）DIV 14支架细胞核的二值化图像；

（e）DIV 28支架细胞核的二值化图像；

（f）祖细胞（巢蛋白）覆盖比例定量，DIV 14时外部区域覆盖度最高，DIV 28时外部区域降低而支撑梁区域升高；

（g）DIV 14对照组巢蛋白的二值化图像，表达广泛；

（h）DIV 28对照组巢蛋白的二值化图像，集中于玫瑰花结（+）；

（i）DIV 14支架巢蛋白的二值化图像；

（j）DIV 28支架巢蛋白的二值化图像，外部区域表达降低（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

图11 替代支架几何结构（含嵌入式希尔伯特曲线的3D晶格）上的hNSC分化情况

（a）支架设计示意图，正交支撑晶格与中心希尔伯特微毛细管整合；

（b）CLSM图像（βIII-微管蛋白为绿色，GFAP为红色，DAPI为蓝色），神经元沿支架特征排列，与主要设计结果一致，表明hNSC分化的空间组织模式在不同支架拓扑结构中具有一致性。

该研究利用双光子光刻技术制备了基于希尔伯特曲线的仿生微毛细管支架，用于引导人类神经干细胞的分化。研究结果表明，该三维支架的特定几何结构能有效调控细胞行为，促进神经元沿管壁形成网络，并引导星形胶质细胞跨越生长。与二维平面相比，支架还延长了干细胞的分化窗口期。尽管该模型未包含血管化功能，但其独特的悬空管状结构为未来构建复杂的神经血管单元奠定了基础。该研究证明，这种可精确调控的支架平台在脑组织工程、药物筛选和神经发育研究方面具有重要潜力。

文章来源：Harris N,Zou M.Controlling the Organization and Differentiation of Human Neural Stem Cells on Hilbert Microcapillary Scaffolds Fabricated via Two-Photon Lithography.Adv Healthc Mater.2025 Sep 6:e01355.

文章网址：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202501355

DOI:10.1002/adhm.202501355