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前瞻洞察|双光子聚合制造类组织支架用于受限环境中肿瘤细胞的行为测试
发布时间:
2025-11-10
引言：在生物材料与癌症研究交叉领域，双光子聚合（Two-Photon Polymerization ,2PP）的高精度3D打印能力是构建类组织微环境支架的关键技术。2025年7月，Alexandra Bran等人的团队于《ACS Applied Bio Materials》发表题为“Tissue-like scaffolds created by two-photon polymerization for testing cancer cell behavior in confined environments”的研究，首次利用2PP技术在SU-8光敏抗蚀剂中制备木堆状3D多孔弹性支架，通过设计亚微米级不同孔径并结合胶原蛋白涂层，模拟肿瘤微环境的物理特性，量化分析了黑色素瘤细胞的黏附、迁移及侵袭行为，揭示了胶原蛋白涂层和孔径大小与细胞侵袭能力的关联规律，并拓展至癌症转移机制研究与个性化治疗等生物医学领域。
摘要：肿瘤细胞在受限空间中的行为与细胞特异性形态变形密切相关，这些变形会进一步影响癌症转移过程的迁移和侵袭机制。因此，构建具有仿生物理特性的细胞外基质样环境作为支架模型，对评估癌细胞的侵袭能力具有重要意义。本研究采用双光子聚合技术，在聚合物材料中制备了具有亚微米级窄孔结构的类组织多孔弹性支架。通过在光敏抗蚀剂（SU-8）中构建木堆型三维支架结构，实现了从微米到亚微米尺度的多级孔径调控，并完成了胶原蛋白涂层修饰。研究人员通过荧光显微镜对细胞核、细胞骨架及黏着斑进行成像，定量分析了癌细胞在支架内的黏附能力和侵袭特性。研究结果表明，经胶原蛋白涂层修饰后，黑色素瘤细胞对支架的亲和性可提升至2倍。此外，相较于未涂层组，胶原涂层能形成更紧密、更牢固的黏着斑连接，将细胞锚定在支架边界及内部空间。与此同时，胶原涂层样品上的黑色素瘤细胞也展现出更大的铺展面积和更高的平均迁移速度。这些现象均与细胞在三维支架上的侵袭行为呈正相关。
图S2 在不同激光功率14、12、9mW(从上到下)和不同扫描速度（75、100、125μm s-1(从左到右）)下制备盖玻片上SU-8木堆状支架的SEM图片。每个支架大小为50×50×50μm3。标尺为400μm。
图1 从延时显微图像中提取的细胞轨迹的可视化表示，每20min记录114h生长在有和无胶原蛋白涂层的盖玻片上的黑色素瘤细胞
（A）在自由空间xy坐标中的轨迹，（B）重叠后与所有轨迹的原点重合，从而评估细胞铺展面积（灰色矩形框）。对4个随机细胞进行跟踪，并对每个细胞轨迹赋予不同的颜色。（C）3种初始细胞密度（1300、2600和5200cm-2）下，黑色素瘤细胞在涂有和不涂胶原蛋白的盖玻片上生长的平均细胞铺展面积（深蓝色和浅蓝色）和平均细胞速度（黑色和紫色）条形图。初始细胞密度为2600cells cm-2的细胞具有最大的铺展面积和铺展速度，被用来估计细胞的平均速度。数据以均数±标准差（mean±SD）表示，统计显著性采用双样本t检验。p＞0.05=ns，p≤0.05=*，p≤0.01=**，p≤0.001=***，且p≤0.0001=****。（D）在初始细胞密度为2600个/cm-2的胶原涂层（黑色）和未涂层（紫色）盖玻片上，连续114h每两帧记录黑色素瘤细胞的平均速度。每个点代表16个细胞速度的平均值。细胞平均速度的线性下降斜率与细胞增殖导致的空间可利用性降低有关。
图2 （A）SU-8支架制作的2PP工艺示意图：采用1.4NA，100x油浸物镜，用高轴向精度的780nm飞秒激光束，在有SU-8负性光刻胶的22×22mm2的正方形盖玻片基底上进行亚微米级的加工。（B）对用于激光辐照的50×50×50μm3木堆状支架设计的CAD图解；插图显示了逐行3D图案化的细节，每一层由周期性的平直聚合物墙（PWs）和相邻PW之间的狭窄空间（NSs）组成。（C）激光、热处理和显影后SU-8聚合物支架的SEM图片；插图显示了逐行处理的3D聚合物图案的细节，并显示了PWs和NSs。
图3 黑色素瘤细胞在所制备的样品上生长20h后，SU-8支架的总览和细节的SEM图像：（A）涂覆胶原和（B）未涂覆胶原。每个大视野显示9个支架，具有3个相似的结构（由水平线）和3个不同的狭窄空间宽度（由列线），分别为0.70、1.10和1.66μm。详细的图像显示了每个狭窄空间维度的代表性支架和高分辨率的SEM图像（红色边界），说明了细胞与支架之间的相互作用。标尺条为200μm的普通视图图像，25μm的单支架细节图像，6μm和3μm的高分辨率图像。
图4 含有3种不同狭窄空间宽度：0.70，1.10，and 1.66μm的SU-8支架的样品上生长20h的侵袭性黑色素瘤细胞的荧光显微图像：（A）胶原涂层样品，（B）无胶原涂层样品。黑色素瘤细胞被染色为细胞核（蓝色），肌动蛋白丝（绿色）和粘着斑蛋白（红色）。细胞形成多个细胞骨架丝状伪足单向穿透支架（黄色箭头），或拉链样穿透（蓝色箭头）。标尺为25μm。
图5 在含有3种不同狭窄空间宽度：0.70，1.10，and 1.66μm的SU-8支架的样品上生长20h的侵袭性黑色素瘤细胞的荧光显微图像，有胶原包被（+Col），无胶原包被（-Col）。黑色素瘤细胞被染色为细胞核（蓝色），肌动蛋白丝（绿色）和粘着斑蛋白（红色）。标尺为25μm。
图6 （A）柱状图显示：（i）在涂有（深蓝色）和无胶原蛋白（浅蓝色）的支架周围的关键区域中，能够伸展细胞骨架形成丝状伪足以穿透支架的细胞核数量；（ⅱ）细胞侵袭面积确定为涂有（深绿色）和无胶原蛋白（浅绿色）的支架底层总的肌动蛋白染色的丝状伪足面积，表明细胞与基底表面接触。数据以平均值±标准差（mean±SD）表示，共有6个相似的支架从2个样品（每个样品包含3个技术重复的相似结构）中收集。（B）代表性的荧光显微镜图像显示在三种不同狭窄空间宽度（0.70，1.10和1.66μm）的情况下，覆盖（上排）和无胶原蛋白（下排）的支架被细胞核（蓝色）包围，并被肌动蛋白细胞骨架（绿色）穿透。
图7 柱状图表示黑色素瘤细胞在3种不同狭窄空间宽度为0.70，1.10和1.66μm的交互作用下形成FAs的数量。被覆（绿色）和无胶原（红色）：（A）在支架内部，（B）在支架边界。每个图是通过收集具有相同实验条件（技术重复3次×2样本）的6个支架的数据而产生的。成熟（M）和非成熟（nM）FAs之间的阈值设置在最大识别的FA点面积的1/4处。45支架内FAs（C）和支架边缘FAs（D）表中列出了未成熟FAs和成熟FAs数量的差异。数据以两样本均数±标准差（mean±SD）（每个样品包含3个技术重复的相似结构）表示，统计显著性采用双样本t检验。p≤0.05=*，p≤0.01=**，p≤0.001=***，且p≤0.0001=****。
该研究有助于揭示癌细胞侵袭机制的细胞与分子基础，不仅可以帮助理解癌细胞扩散方式并提出新型治疗策略，还可为获取受体和配体特性对细胞行为反应的量化影响提供数据支持。因此，该模型可作为基础研究工具，通过表征受体与配体之间或这些分子与其他细胞组分相互作用的生物化学和生物物理参数，来预测细胞行为（如增殖速率、粘附强度、迁移速度、迁移方向等）的量化指标。
文章来源：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsabm.5c01009
DOI：10.1021/acsabm.5c01009
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